原發(fā)登革熱IgG間接法檢測試劑
Panbio Dengue IgG Indirect ELISA
產(chǎn)品目錄號01PE30
預期用途
Panbio Dengue IgG Indirect ELISA用于定性檢測登革熱病原血清型（1、2、3和4）血清中的IgG抗體，輔助臨床實驗室診斷出現(xiàn)臨床癥狀或既往感染登革熱病毒的患者。
概述
蟲媒病毒中的登革熱屬通過蚊子傳播，主要是埃及伊蚊和白紋伊蚊。 登革熱病毒感染，與傷寒病有關(guān)，其特征是突然發(fā)熱、劇烈頭痛、肌痛、關(guān)節(jié)痛和皮疹。 登革熱感染的嚴重并發(fā)癥包括登革出血熱和登革休克綜合征。此類并發(fā)癥的發(fā)病率增加與繼發(fā)性感染不同登革熱血清型有關(guān)。
通過ELISA對四種登革熱血清型的IgG類特異性抗體進行檢測，是一種診斷既往感染登革熱病毒的患者的重要方法。 配對血清中IgG， 水平不斷升高是活動性登革熱感染的表現(xiàn)。傳統(tǒng)上，血凝抑制試驗（HAI）滴度被用于劃分原發(fā)性或繼發(fā)性感染。當前的界定方法是采用及時分離至少7天的配對血清標本檢測，急性標本的HAI滴度≥ 1:2560被認為患者感染了繼發(fā)性黃病毒1。
檢測原理
血清中存在的登革熱病毒抗體，與微孔測試條上聚苯乙烯表面附著的登革熱抗原結(jié)合物相結(jié)合。 洗去剩余的血清并添加過氧化物酶標記的抗人IgG抗體。清洗微孔，再添加無色的底物系統(tǒng) - 四甲基聯(lián)苯胺/過氧化氫（TMB顯色液）。底物被酶水解后，顯色液變藍。用酸終止反應后，TMB變黃。顯色表示測試樣本中存在登革熱IgG抗體。
提供的材料
- 登革熱抗原（血清型1、2、3和4）包被微孔板-（12x8孔）。即用型。未使用的微孔應該立即重新密封并儲存于干燥環(huán)境中。有效期內(nèi)儲存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
- 清洗緩沖液（20倍） - 1瓶，60mL 20倍濃縮磷酸鹽緩沖鹽水（pH 7.2 – 7.6），含吐溫 20和防腐劑（0.1% Proclin™）。低溫可能結(jié)晶。若去除結(jié)晶，可在37℃孵育液體至澄清。混合均勻。用19體積的蒸餾水稀釋1體積的清洗緩沖液。稀釋后的緩沖液可在2-25℃儲存一周。
- 樣本稀釋劑 – 2瓶， 50 mL（粉色）。即用型。Tris緩沖生理鹽水（pH 7.2 – 7.6），含防腐劑（0.1% Proclin™）和添加劑。有效期內(nèi)儲存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
- HRP標記抗人IgG – 1瓶，15mL（綠色）。即用型。辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗人IgG，含防腐劑（0.1% Proclin™）和蛋白穩(wěn)定劑。有效期內(nèi)儲存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
- TMB顯色液（TMB） - 1瓶，15mL。即用型。3,3’,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫的混合物，存放于枸櫞酸鹽緩沖液中（pH 3.5 – 3.8）。有效期內(nèi)儲存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
- 陽性質(zhì)控品 – 1瓶，紅色瓶蓋，200μL人血清（含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素）。有效期內(nèi)儲存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
- 校準品 – 1瓶，黃色瓶蓋，850μL人血清（含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素）。有效期內(nèi)儲存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
- 陰性質(zhì)控品 – 1瓶，綠色瓶蓋，200μL人血清（含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素）。有效期內(nèi)儲存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
- 終止液 – 1瓶，紅色瓶蓋，15mL。即用型。1M磷酸。有效期內(nèi)儲存于2-25℃可保持穩(wěn)定。
Proclin™ 300是Rohm 和Haas公司的注冊商標。
需要但未提供的材料
- 精確、可調(diào)節(jié)的微量移液器，含一次性吸液頭（5-1000 μL容積）
- 去離子水
- 標板清洗系統(tǒng)
- 酶標儀，含450nm濾波器
- 計時器
- 刻度量筒
- 燒瓶
- 試管或微滴定板，用于稀釋血清
注意事項
用于體外診斷
- 在制備質(zhì)控品的過程中使用的所有人源性材料已經(jīng)過人類免疫缺陷病毒1/2（HIV 1 /2）抗體、丙肝（HCV）和乙肝表面抗原的檢測，結(jié)果為陰性。但是，任何測試方法都不能*確信，且所有人源性質(zhì)控品和抗原包被微孔板都應按照潛在傳染性材料處理。疾病控制和預防中心以及美國國立衛(wèi)生研究院建議將潛在傳染原按照生物安全二級2處理。
- 該測試只能使用血清執(zhí)行。尚未建立使用全血、血漿或其它標本基質(zhì)的方法。
- 不可使用黃疸或脂血癥血清，以及出現(xiàn)溶血或微生物生長的血清。
- 不可加熱，否則血清將失去活性。
- 在開始檢測前所有試劑必須平衡至室溫（20-25℃）。檢測受溫度變化的影響。微孔板在達到室溫（20-25℃）之前不可從密封袋中取出。
- 直接用干凈的吸液頭從試劑瓶中吸出試劑。轉(zhuǎn)移試劑可能導致污染。
- 未使用的微孔應該立即重新密封并儲存于干燥環(huán)境中。否則將產(chǎn)生錯誤結(jié)果。
- 底物系統(tǒng)：
- 由于TMB易受金屬離子的污染，所以底物系統(tǒng)不能與金屬表面接觸。
- 避免長時間陽光直射。
- 有些清潔劑可干擾TMB的性能。
- TMB可能呈現(xiàn)淡藍色，這不影響底物的活性或測定結(jié)果。累積。
- 疊氮話鈉還抑制酶標物的活性。在添加酶標物時必須使用干凈的吸液頭，避免攜帶其它試劑的疊氮話鈉。
標本采集和制備
靜脈穿刺獲取的血液應該置于室溫（20-25℃）下直到凝塊形成，再按照臨床實驗室標準化研究院（CLSI）的《認可標準——診斷用血液標本的靜脈穿刺采集程序，H3》離心。應該盡快分離血清。如果在2天內(nèi)不進行檢測，血清應該2-8℃冷藏或者低于或等于- 20℃冷凍儲存。不*使用自解凍冷凍機儲存血清。不*使用黃疸血清，以及出現(xiàn)溶血、脂血或微生物生長的血清。CLSI提供了儲存血液標本的建議，《認可標準——血液標本的處理加工程序，H18》。
檢測程序
注： 確保所有試劑在開始測定前平衡至室溫（20-25℃）。在所給時間和溫度范圍以外進行測試可能產(chǎn)生無效的結(jié)果。不在預定時間和溫度范圍內(nèi)的測試必須進行重復。
ELISA程序
- 從鋁箔袋中取出所需數(shù)量的微孔板并插入測試條槽。陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和校準品各需5個微孔，一式三份。確保剩下未使用的微孔密封于鋁箔袋內(nèi)。
- 使用適當?shù)脑嚬芑蛭⒌味ò逑♂岅栃再|(zhì)控品（P）、陰性質(zhì)控品（N）、校準品（CAL）和患者樣本。
- 混合10μL血清與1000μL樣本稀釋劑。混合均勻。
或者，
- 混合10μL血清與90μL樣本稀釋劑。取出20μL稀釋血清，加入180μL樣本稀釋劑?；旌暇鶆?。
- 吸取100 µL樣本稀釋劑、質(zhì)控品和校準品添加至對應的微孔中。
- 蓋住測定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘。
- 用稀釋后的清洗緩沖液洗6次（參考清洗程序）。
- 吸取100 µL HRP標記抗人IgG添加到每個微孔中。
- 蓋住測定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘。
- 用稀釋后的清洗緩沖液洗6次（參考清洗程序）。
- 吸取100 µL TMB添加到每個孔中。
- 在室溫（20-25℃）下孵育10分鐘，從第①次添加開始計時。藍色將會顯現(xiàn)。
- 按照相同順序吸取100μL終止液添加到每個孔中，計時同TMB添加步驟?；旌暇鶆?。藍色將變成黃色。
- 在30分鐘內(nèi)讀取每個孔在450nm波長的吸光度，參考濾波器為600-650nm。
注： 如果使用雙波長分光光度計，將參考濾波器設(shè)定在600-650nm之間。在沒有參考濾波器的情況下讀取450nm的微孔結(jié)果可能由于背景原因?qū)е挛舛绕摺?/span>
清洗程序
為了清除未復合的樣本或成分，有效清洗是ELISA程序的關(guān)鍵步驟。
A.自動洗板機
- *抽凈所有微孔。
- 在清洗循環(huán)期間將每個孔裝滿至邊緣（350μL）。
- 完成6次清洗后，將測定板倒立于吸水紙巾上用力敲打，確保清除所有清洗緩沖液。
- 為了確保有效清洗，必須維持自動洗板機良好的保養(yǎng)。必須始終遵守廠商的清潔說明。
B.手動清洗
- 將測定板的內(nèi)含物丟棄到適當?shù)膹U物容器。
- 用適當?shù)臄D壓瓶將微孔填滿清洗緩沖液。避免清洗緩沖液起泡，否則會降低清洗效率。立即丟棄微孔里的清洗緩沖液。
- 再將微孔填滿清洗緩沖液，并立即丟棄。
- 重復步驟（3）4次，共用清洗緩沖液清洗六（6）次。
- 后一次清洗完成后，丟棄微孔的內(nèi)含物并將測定板置于吸水紙巾上敲打，以確保清除所有清洗緩沖液。
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